CJI (Traditional Chinese Medicine)
肝豆汤Ⅱ号调控TGF-β1/Smad通路抑制肝豆状核变性小鼠肝纤维化的机制研究
1,2,董健健1,2,程楠1,2,韩咏竹1,2
周丹
1.安徽中医药大学,安徽 合肥 230012;
2.安徽中医药大学神经病学研究所,安徽 合肥 230061
摘要:目的 研究肝豆汤Ⅱ号调控TGF-β1/Smad通路对肝豆状核变性小鼠肝纤维化的影响及机制。方法 以DL小鼠为对照组,将TX小鼠随机分为模型组和中药低、高剂量组,中药组分别予常规剂量和高剂量肝豆汤Ⅱ号灌胃,对照组和模型组予蒸馏水灌胃,连续30 d。ELISA检测小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)、透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(HPCⅢ)、层粘连蛋白(LN)含量,Masson染色观察肝组织纤维化程度,免疫荧光染色检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) α-SMA、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、表达,电感耦合等离子体质谱法检测肝组织铜、铁离子含量,RT-qPCR检测肝组织
ColⅠ、转化生长因子-β1 (TGF-β1 )及 Smad2/3 mRNA 表达,Western blot检测肝组织α -SMA、 TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3蛋白表达。结果 与对照组比较,模型组小鼠血清ALT、AST、ColⅣ、HA、HPCⅢ、LN含量均显著升高(P<0.05,P<0.01),肝组织胶原容积分数显著增加、α-SMA表达显著升高(P<0.01),肝ColⅠ
组织铁离子含量显著升高(P<0.01), α -SMA、 、TGF-β1、Smad2/3 mRNA和蛋白表达显著升高, p-Smad2/3蛋白表达显著升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,中药低、高剂量组小鼠血清ALT、AST、ColⅣ、HA、HPCⅢ、LN含量均显著降低(P<0.05,P<0.01),肝组织胶原容积分数显著减少、α-SMA表达显著降低(P<0.01),肝组织铜和铁离子含量显著升高(P<0.01),α-SMA、ColⅠ、TGF-β1、Smad2/3 mRNA和蛋白表达显著降低,p-Smad2/3蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论 肝豆汤Ⅱ号可通过调控TGF-β1/ ColⅠ、α-SMA
Smad通路下调 和TGF-β1表达,抑制肝豆状核变性小鼠肝纤维化,减轻铜蓄积诱导的肝脏病理损伤。
关键词:肝豆状核变性;肝豆汤Ⅱ号;肝纤维化;TGF-β1/Smad通路;小鼠
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2024)05-0061-07 DOI:10.19879/j.cnki.1005-5304.202310283 开放科学(资源服务)标识码(OSID):
Study on the Mechanism of Gandou Decoction Ⅱ in Regulating TGF-β1/Smad Pathway to Inhibit Hepatic Fibrosis in Wilson Disease Mice
ZHOU Dan1,2, DONG Jianjian1,2, CHENG Nan1,2, HAN Yongzhu1,2
1. Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China;
2. Institute of Neurology, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230061, China
Abstract: Objective To study the effects and mechanism of Gandou Decoction Ⅱ in regulating TGF-β1/Smad pathway for hepatic fibrosis in Wilson disease mice. Methods DL mice were set as the control group, while TX mice were randomly divided into the model group, TCM low- and high-dosage groups. TCM groups were given routine dosage and high-dosage Gandou Decoction Ⅱ by gavage respectively, while the control group and model group were administered distilled water by gavage for 30 consecutive days. ELISA was used to detect the contents of alanine基金项目:安徽省自然科学基金(2208085MH226);安徽省高等学校科学研究项目(2023AH050778);合肥综合性国家科学中心大健康研究院新安医学与中医药现代化研究所“揭榜挂帅”项目(2023CXMMTCM002)通讯作者:韩咏竹,E-mail:yongzhuhan@163.com
aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), collagen type Ⅳ (Col Ⅳ), hyaluronic acid (HA), procollagen type Ⅲ (HPCⅢ), and laminin (LN) in serum, Masson staining was used to observe the degree of liver tissue fibrosis, while immunofluorescence staining was used to detect α-SMA expression in liver tissue, inductively coupled plasma mass spectrometry was used to detect copper and iron ion content in liver tissue, and RT-qPCR was used to detect the expressions of α-SMA,collagen type Ⅰ (ColⅠ), transforming growth factor-β1 (TGF-β1), and Smad2/3 mRNA in liver tissue, Western blot was used to detect of protein expressions of α-SMA, ColⅠ, TGF-β1, p-Smad2/3 and Smad2/3 in liver tissue. Results Compared with the control group, the contents of serum ALT, AST, ColⅣ, HA, HPCⅢ and LN significantly increased in the model group (P<0.05, P<0.01), the collagen volume fraction of liver tissue significantly increased, the expression of α-SMA significantly increased (P<0.01), the iron ion content in liver tissue significantly increased (P<0.01), α-SMA, ColⅠ, TGF-β1, Smad2/3 mRNA and protein expressions significantly increased, and the expression of p-Smad2/3 protein significantly increased (P<0.05, P<0.01). Compared with the model group, the contents of serum ALT, AST, ColⅣ, HA, HPCⅢ and LN significantly decreased in TCM low- and high-dosage groups (P<0.05, P<0.01), the collagen volume fraction of liver tissue significantly decreased, the expression of α -SMA significantly decreased (P<0.01), and the copper and iron ion content in liver tissue significantly increased (P<0.01), α-SMA, ColⅠ, TGF-β1, Smad2/3 mRNA and protein expressions were significantly decreased, and p-Smad2/3 protein expression significantly decreased (P<0.05, P<0.01). Conclusion Gandou Decoction Ⅱ can regulate TGF-β1/Smad pathway to down-regulate the expressions of ColⅠ, α-SMA, and TGF-β1, inhibit hepatic fibrosis in Wilson disease mice and alleviate copper accumulation induced liver pathological damage.
Keywords: Wilson disease; Gandou Decoction Ⅱ; liver fibrosis; TGF-β1/Smad pathway; mice肝豆状核变性(Wilson disease,WD)是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍性疾病。WD患者因ATP7B基因发生突变,导致肝脏、大脑和其他器官铜稳态受损和铜过载[1-2]。因种族和个体差异,铜离子在各脏器沉着速度、部位及分布程度不同,出现复杂的临床表现,但无论是脑型、肝型还是其他类型,所有患者均表现出不同程度的肝脏慢性损害[3-4]。肝纤维化是WD主要病理改变,因此,减轻或延缓肝纤维化对该病治疗具有重要意义[5]。目前,以青霉胺为代表的金属离子螯合剂是治疗该病的首选药物,但部分患者易出现严重不良反应,临床获益患者有限,开发不良反应少、治疗靶点精准的药物成为治疗WD肝纤维化的重要突破点[6]。
根据WD中医辨证结果[7],从WD肝纤维化“久病致瘀”及患者先天禀赋不足的证候特点出发,安徽中医药大学神经病学研究所创立肝豆汤Ⅱ号治疗
WD肝纤维化获得显著疗效,然其机制尚不明确。肝星状细胞(HSC)是进展性肝纤维化的关键效应细胞,在纤维化的肝脏中,静止的HSC被激活并分化为肌成纤维细胞,此类细胞是细胞外基质(ECM)的主要来源。同时,转化生长因子-β1(TGF-β1)在促进
HSC活化和肌成纤维细胞分化中起重要作用[8]。研究显示,铜通TGF-β1/Smad
过激活 通路诱导ECM沉积,促进纤维化
TGF-β1/Smad通路研究肝豆汤Ⅱ发展[9]。本研究基于号对WD模型小鼠肝纤维化的影响及作用机制,以期
Ⅱ号治疗
为肝豆汤WD提供实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级TX小鼠45只、DL小鼠15只,3~4月龄,体质量(20±5)g,TX小鼠种鼠及其对照DL小鼠均从美国 Jackson 实验室中心引进(各 8 只,编号3902571),于安徽中医药大学神经病学研究所SPF级实验动物中心繁殖饲养。对DL纯合及TX纯合小鼠分别进行合笼处理,为保证TX种鼠及其子代具备WD模型特性,TX小鼠入组动物均已进行基因检测。动物使用许可证号SYXK (皖) 2018-005,动物合格证号3198342。本研究经安徽中医药大学动物伦理委员会审批(IACUC19001)。
1.2 药物及制备肝豆汤Ⅱ号组成:黄芪
20 g,牡丹皮15 g,赤芍15 g,白芍15 g,川芎10 g,莪术10 g,桃仁10 g,红花6g。取7剂处方量饮片,加蒸馏水浸泡30 min,大火煮沸后再以文火煎30 min,过滤,药渣加蒸馏水重复煎煮,合并滤液,文火浓缩至933.33 mL(含原药材0.757 5 g/mL),冷却后取266.66 mL为常规剂量(临床等效剂量),取533.33 mL继续文火浓缩至266.66 mL为高剂量。分别倒入棕色瓶内,于4℃冰箱保存备用。
1.3
主要试剂与仪器
α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体(货号兔抗
Ⅰ Ⅰ
R23450 )、兔抗 型胶原( Col )抗体(货号
β1 501352)、兔抗 TGF- 抗体(货号346599)、兔抗Smad2抗体(货号R25742)、兔抗p-Smad2抗体(货号R26361)、兔抗 Smad3抗体(货号R25743)、兔抗p-Smad3抗体(货号380775)、HRP标记山羊抗兔IgG (货号511203),成都正能生物技术有限公司;天冬氨酸氨基转移酶(AST)ELISA试剂盒(货号BC1565)、丙氨酸氨基转移酶( ALT) ELISA 试剂盒(货号BC1555),北京索莱宝科技有限公司;小鼠Ⅳ型胶原(ColⅣ)ELISA JL20128)、小鼠Ⅲ型前
试剂盒(货号胶原(HPCⅢ)ELISA
试剂盒(货号JL25714)、小鼠透明质酸(HA)ELISA试剂盒(货号JL12406)、小鼠层粘连蛋白(LN)ELISA试剂盒(货号JL20286),上海江莱生物。NexION350D型电感耦合等离子体质谱仪,美国PerkinElmer公司;Epoch2型全波长酶标仪,美国BioTek公司;EPS-300型蛋白电泳及转膜仪,美国伯乐公司;KZ-Ⅱ高速组织研磨仪,武汉赛维尔生物;TGL-16型台式高速冷冻离心机,湖南湘仪。
2 实验方法
2.1 分组及给药
将TX小鼠随机分为模型组和中药低、高剂量组,每组15只,15只DL小鼠为对照组,适应性饲养3 d后,中药低、高剂量组分别予常规剂量(15.15 g/kg)
g/kg)肝豆汤Ⅱ号灌胃,对照组和模型和高剂量(30.3
组予蒸馏水灌胃,灌胃体积20 mL/kg,每日1次,连续30 d。
2.2 取材
给药结束后,3%戊巴比妥钠过量麻醉处死,腹主动脉取血,室温放置2h,3 500 r/min离心15 min,分离血清,-80 ℃保存,用于ELISA检测。采血后迅速剪开小鼠腹腔,取出完整肝脏,部分肝组织于4%多聚甲醛溶液中固定,用于Masson和免疫荧光染色,部分肝组织于RNA固定液中固定,用于RT-qPCR检测,剩余肝组织液氮速冻,-80 ℃冰箱保存,用于电感耦合等离子体质谱和Western blot检测。
2.3 ELISA检测
按ELISA试剂盒说明书操作,测定小鼠血清ALT、AST、ColⅣ、HPCⅢ、HA、LN
含量。
2.4 Masson染色
固定好的肝组织水洗后,经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等过程制作石蜡切片,按Masson染色试剂盒步骤染色,1%冰醋酸漂洗分化,无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光学显微镜下观察,采集图像后经 Image J软件分析,计算胶原容积分数(CVF)。CVF(%)=胶原纤维面积÷总面积×100%。2.5 免疫荧光检测
肝组织石蜡切片常规脱蜡至水,柠檬酸钠高压修复,PBS洗3次,每次5 min,3%H2O2室温避光孵育10 min去除内源性酶,PBS洗5 min×3次,10%BSA室
α-SMA
温封闭30 min,加入 一抗(1∶1 000),4 ℃孵育过夜,PBS洗3次,滴加荧光二抗(1∶300),室温避光孵育50 min,PBS洗3次,加DAPI染液,避光孵育10 min,PBS洗3次,加入自发荧光淬灭剂B液孵育5 min,流水冲洗10 min,抗荧光淬灭封片剂封片,观察α-SMA
荧光表达情况,Image J软件计算荧光面积比(荧光面积÷总面积×100%)。
2.6 电感耦合等离子体质谱检测
①样品消化分解:收集小鼠肝组织,每管加入95%浓硝酸6 mL,放入微波消解仪中消解,至管内组织完全消化分解,管内液体呈澄清透明,置于4 ℃待测。②建立标准曲线:使用调谐液调整射频功率、气体流量、标准度、扫描时间和次数等仪器参数。稀释标准曲线溶液,浓度由低到高,空白管为双蒸水,重复测3次,根据空白管和标准管数值建立标准曲线。③上机检测:稀释各组样品,依次上机检测(重复测3次),将所测数值根据标准曲线、样品质量和样品稀释倍数计算铜和铁含量。
2.7 RT-qPCR检测
取肝组织10~20 mg,研磨,离心,抽提总RNA,反转录获取cDNA。配制反应体系,共20 µL。PCR条件:94 ℃、3 min,94 ℃、10 s,60 ℃、30 s,共40个
β-actin为内参,2-ΔΔCt
循环。以 法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。
表1